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RFHR二次元電気泳動装置
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About the RFHR metod of 2D PAGE
Protein analysis services
RFHR二次元電気泳動法はKaltschmidt-Wittmann法の流れを汲んで和田明が開発した電気泳動法で、1986年に初めて発表され、その後の改良を経て現在に至っています。塩基性蛋白質の分離に優れ、かつ蛋白スポットの蛋白量は高い定量性を持った方法です。「RFHR法」はradical-free and highly reducingの略で「アルファ法」と呼ばれており、室温風冷による標準型と、水冷による精密分離型の二つのタイプがあります。ここで標準型について詳細に説明します。
0次元泳動装置 1次元泳動装置 2次元泳動装置
1.RFHR法の特徴
1.0次元泳動を行い、蛋白質を高度に濃縮する。         
  1次元泳動の前に、短い0次元ゲルに、蛋白質を高度に濃縮泳動させる。そのゲルから蛋白バンドを含むゲル片を切り出し、1次元ゲルの中間地点に挿入する。

2.1次元ゲルは等pH電気泳動であり、等電点泳動くを行わない。         
  1次元は7%ゲル、pH8.6の等pH電気泳動であり、各蛋白質のネットチャージによる泳動速度の違いによって分離する。         
3.塩基性蛋白質の分離に優れる。         
  等電点電気泳動を採用しないため、等電点の如何にかかわらず蛋白質を分離できる。したがってとくに等電点法の不得手な塩基性蛋白質の分離に優れている。逆に等電点への濃縮効果を持たないため、中性〜酸性領域のスポットは1次元方向のシャープさに劣る。         

4.2次元も等pH電気泳動であるが、SDSを使用しない。         
  2次元は17%ゲルの分子篩とpH3.6におけるネットチャージによる泳動速度の違いによって蛋白分子を分離するが、SDSを使用しないため激しい変性を免れており、その後の機能解析に適する。         

5.泳動前にゲル中のフリーラジカルを一掃し、蛋白修飾を阻止する。         
  全てのゲルに対して電荷をもったラジカル・スカベンジャーをプレランし、あらかじめフリーラジカルを除去することによって泳動中の蛋白分子がフリーラジカルに修飾されるのを防ぐ。         

6.ゲル中の環境を還元的に保ち、システイン−システイン架橋を阻止する。         
  酸化的環境下で蛋白分子に発生するシステイン−システイン架橋を阻止するため、蛋白質を泳動させる際、電荷をもった還元剤を同時に泳動させ、ゲル中を高い還元的環境に保つ。         

7.複数のスポットに分裂しにくいため、単一スポットから蛋白量を定量できる。         
  等電点法では複数の等電点にスポットが分裂するが、RFHR法ではこの分裂が起こりにくい。したがって、単一のスポットのデンシトメトリーによって細胞中の各蛋白質の分子量を定量することが可能である。
→1.RFHR法の特徴(PDF)はこちら
2.標準型の操作
・使用する装置と道具類〜 ・使用する試薬類→詳細説明(PDF)はこちら
・蛋白質試料の調製〜 ・蛋白水溶液の作成〜 ・STOCK SOLUTIONS→詳細説明(PDF)はこちら
・装置の組み立てとゲル作成〜 ・0Dゲル作成〜 ・1Dゲル作成〜 ・2Dゲル作成→詳細説明(PDF)はこちら
・プレラン→詳細説明(PDF)はこちら           
・本泳動 蛋白質の分離〜 ・0D泳動〜 ・1D泳動〜 ・2D泳動→詳細説明(PDF)はこちら           
・染色と脱色〜 ・記録と保存→詳細説明(PDF)はこちら           
・実験の日程と目安→詳細説明(PDF)はこちら
3.データ・参照文献
RFHR法
1.Wada,A(1986)
Analysis of Escherichia coli ribosomal proteins by an improved two dimensional gel electrophoresis 1. Detection of four new proteins.
J. Biochem. 100 (1583-1594)

2.Wada,A(1986)
Analysis of Escherichia coli ribosomal proteins by an improved two dimensional gel electrophoresis 2. Detection of four new proteins.
J. Biochem. 100 (1595-1605)

3.Wada,A.and Sako,T.(1987)
Primary structures of and genes for new ribosomal proteins A and B in Escherichia coli.
J. Biochem. 101 (817-820)
最近の修正点
4.Ueta,M., Wada,C. and Wada,A(2010)
Formation of 100S ribosome in Staphylococcus aureus by the hibernation promoting factor homolog SaHPF
Genes Cells  15 (43-58)
蛋白質調製
酢酸法
5.Hardy,S.J.S.,Kurland,C.G.,Voynow,P.and Mora,G.(1969)
The ribosomal proteins of E.coli. I.Purification of 30S ribosomal proteins.
Biochemistry8 (2897-2905)
RFHR法の製造販売とお問合せはこちらまで
▼RFHR二次元電気泳動法の装置は、葛g田生物研究所で製造・販売しております。▼
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